Особенности спектрального анализа

Многие соединения обладают способностью поглощать свет конкретной длины волны в диапазоне от инфракрасного до ультрафиолетового излучения.

Измерение осуществляются с помощью приборов, именуемых спектрофотометрами. Эти приборы, используемые для лабораторных анализов, распространены во всем мире.

Длины волн электромагнитного излучения

Видимый спектр света (между инфракрасным и ультрафиолетовым), который является частью электромагнитного излучения, воспринимается человеческим глазом как свет определенного цвета, от фиолетового до красного. Длина волн видимого электромагнитного излучения, воспринимаемого нами как свет определенного цвета, находится в диапазоне от 620 до 700 нанометров (для красного), и от 380 до 450 нм (для фиолетового). За пределами этих диапазонов, излучение становится невидимым. То есть, если длина волны более 750 нм, то это уже инфракрасное излучение, а если длина волн менее чем 350 нм — ультрафиолетовое.

Поглощение (абсорбция) света веществами, определенной длины волны

Почти любое вещество, способно поглощать свет определенной длины волны. Например, яблочный сок поглощает лучи желтого цвета, поскольку он поглощает свет конкретной длины волны и свободно пропускает излучение с другой длиной волны. Многие опытные образцы, исследуемые в химических лабораториях, имеют одинаковые свойства в том смысле, что способны поглощать свет в узком спектре лишь одной длины волны, при этом, не поглощая излучение, имеющее другую длину волны. Поглощение конкретной длины волны света может быть измерено с помощью спектрофотометра. Данный прибор может быть использован для обнаружения белков, ферментативных реакций, нуклеиновых кислот и целого ряда других веществ.

Принцип работы спектрофотометра

В промышленности, наиболее широко используется лабораторный спектрофотометр типа UF-Visible. В данном приборе, в качестве источника света, используются ртутные или ксеноновые газоразрядные лампы (для создания ультрафиолетовой части спектра излучения), наряду с вольфрамовыми лампами накаливания или даже светоизлучающими диодами (СИД) (для создания видимого спектра излучения). Луч попадает на монохроматор (устройство, которое пропускает излучение определенной длины волны). Далее оптическое излучение проходит сквозь камеру с пробой, в которой собственно и происходит поглощение лучей исследуемым веществом. Чем больше концентрация исследуемого вещества в пробе (образце), тем интенсивнее будет поглощение излучения. После этого, излучение поступает в электронный фотоприемник (фотоэлемент или фотоэлектронный умножитель). Выходной электрический сигнал с фотоприемника далее поступает на усилитель, а после чего преобразовывается, обрабатывается и анализируется микроконтроллером (то есть далее работает уже электроника).

Оптические свойства исследуемых проб

Любые цветные материалы имеют определенный спектр поглощения. Многие анализы, совершаемые в лаборатории биохимических соединений, основаны на том, что молекулы, вступая в химическую реакцию друг с другом, изменяет свой цвет. Таким образом, используя спектрофотометр для измерения концентрации растворенного вещества, формируется оценка степени протекающей химической реакции. Эти так называемые «колориметрические анализы», которые используются для различных целей, например для оценки активности фермента, выявления количества специфических антител, или даже для определения количества сахара в растворе. Поглощения излучения в ультрафиолетовом спектре является важным принципом для исследований в лабораториях биохимии. Следует отметить, что человеческий глаз не видит ультрафиолетовое излучение именно по тому, что почти все нуклеиновые кислоты и белки поглощают ультрафиолет.

Если биологические макромолекулы не имеют каких-либо видимых окрасок, это отнюдь не означает, что они не поглощают излучение. В ультрафиолетовом диапазоне электромагнитного спектра вполне реально проводить анализы очищенных белков или нуклеиновых кислот, так как они способны поглощать ультрафиолетовые лучи.

Белки представляют собой полимеры с химическим содержанием аминокислот фенилаланина, триптофана, тирозина и отличаются от всех других аминокислот, поскольку они содержат боковые цепи с так называемыми «ароматическими кольцами». Эти кольцевые структуры способны очень сильно поглощать свет в ультрафиолетовой области спектра, при длине волн около 280 нм. Нуклеиновые кислоты полимеров построены из фосфат-азотистых нуклеотидов. Это является «базой» строительных блоков ДНК и РНК. Все «базы» ДНК и РНК также способны поглощать электромагнитное излучение в ультрафиолетовом диапазоне. Только, в отличие от ароматических аминокислот, они поглощают при длинах волн около 260 нм.

Эту особенность белков и нуклеиновых кислот использовали для оценки повседневных исследований белков и нуклеиновых кислот. А также для сравнения относительных количеств поглощения на длинах волн 260 нм и 280 нм. На основании чего и делали заключение о чистоте.

03.05.2010