Зачем и как ученые Нейрокампуса РНИМУ выращивают органоиды мозга в пробирке
Недостаточность мозгового кровообращения (ишемия) — одно из сосудистых заболеваний головного мозга. Этот клинический диагноз официально относят к подклассу цереброваскулярных болезней.
По последним данным, более девяти миллионов человек в мире страдают от таких патологий, а это почти 12% смертности. Сосудистые болезни мозга в страшной статистике уступают только заболеваниям сердца и онкологии. Симптомы ишемического инсульта проявляются не сразу, что усложняет оперативную постановку диагноза. Над решением этой проблемы работают и ученые. Долгое время моделирование подобных процессов было возможно исключительно на лабораторных животных, но не все полученные эффекты оказались применимы к человеку.
Тогда ученые из Нейрокампуса РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России занялись исследованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и выращиванием в пробирке органоидов мозга. О том, как это происходит, каких результатов удалось достичь и как научная работа поможет в терапии ишемии, нам рассказала Вероника Усатова, научный сотрудник лаборатории нейротехнологий Института фундаментальной неврологии Федерального центра мозга и нейротехнологий ФМБА России.
Моделирование процессов и заболеваний нервной системы
Направление, связанное с исследованиями ИПСК, и в частности с созданием органоидов мозга, возникло в Федеральном центре мозга и нейротехнологий три года назад, при формировании в структуре учреждения Института фундаментальной неврологии.
В науке до появления технологии получения ИПСК моделирование процессов и заболеваний нервной системы человека было возможно только при использовании лабораторных животных, эффекты и закономерности, полученные на которых, часто не воспроизводились на человеке. Применение ИПСК человека позволило получать не только видоспецифичный материал, но и сохранять геномные особенности конкретных доноров.
В органоидах мозга, представляющих собой трехмерные культуры, в которых развиваются специфичные типы клеток, достигаются приближенные к физиологически нормальным межклеточные взаимодействия и градиент растворимых факторов. Это позволяет изучать на данных объектах особенности развития человеческого мозга в норме и патологии, моделировать различные неврологические расстройства человека, исследовать патогенетические механизмы и определять эффективность лечения пациентов.
«Поп-ит» для создания зачатка нервной системы
Формирование сфероидов и их последующая дифференцировка (превращение) в органоиды мозга могут осуществляться учеными различными способами в зависимости от целей. Рассмотрим один из возможных вариантов.
На первом этапе получают эмбриоидные тела с потенциалом развития клеток в три зародышевых листа: энтодерму, эктодерму и мезодерму. Это необходимо для формирования прототипа внутренней клеточной массы на стадии перед гаструляцией (как при естественном развитии эмбриона человека). Для этого ИПСК помещают в специальные формочки из агарозы с большим количеством ячеек, похожие на поп-ит. В них клетки оседают, не связываются со стенками формы, а образуют только межклеточные контакты. Размер сферы зависит от количества клеток и диаметра лунки.
На всех стадиях роста для сфер создаются необходимые условия культивирования — они помещаются в инкубатор при температуре 37°C, поддерживается влажность 70% и уровень CO2 5%.
Через несколько дней в составе среды заменяются компоненты на те, которые инициируют образование нейроэктодермы — зачатка нервной системы. Затем происходит замена среды на подходящую для генерации нейральных предшественников, из которых могут образовываться как нейроны, так и астроциты.
Завершающим этапом является стадия матурации (взросления). Здесь состав среды подбирается таким образом, что процессы деления клеток замедляются, при этом нейроны в составе органоида приобретают различные функции и образуют между собой связи.
На разных стадиях дифференцировки ученые оценивают, из каких клеток состоит органоид (методом иммуноцитохимии или проточной цитофлуорометрии), а также функциональную зрелость нейронов (методом локальной фиксации потенциала действия).
Совершенствование терапии при ишемии
Одно из направлений нашей команды в данной области исследований — определение особенностей молекулярных механизмов ишемии и последующей реперфузии мозга (повреждение ткани, вызванное возвращением к ней кровоснабжения. — Прим. ред.) в острой фазе. Общепринятым мнением является участие в патогенезе инсульта активных форм кислорода, которые при неконтролируемой генерации приводят к окислительному стрессу.
Окислительный стресс в тканях мозга при инсульте неоднократно подтверждался, но косвенными методами. В режиме реального времени на нейральных клетках человека он до этого никогда не исследовался напрямую. Понимание данных механизмов может выявить пути в терапии, направленной на коррекцию метаболических и сигнальных процессов при ишемии.
Визуализация метаболических процессов
В рамках исследования мы получили органоиды мозга, в геном клеток которых встроили белковые флуоресцентные биосенсоры, чтобы визуализировать метаболические процессы. Данный подход позволяет через динамику флуоресцентного сигнала отражать изменения изучаемого параметра, например перемены концентрации соединения, с которым взаимодействует сенсорная часть биосенсора. Таким образом, мы получили возможность в режиме реального времени наблюдать, как меняется уровень пероксида водорода, рН и соотношения НАД+/НАДН.
Далее, моделируя ограничение кровотока в мозге, мы создаем условия глюкозно-кислородной депривации, то есть лишаем органоиды мозга кислорода и глюкозы в жидкостном и воздушном окружении. В моменты гипоксии и последующей реоксигенации с помощью флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени мы наблюдаем за изменениями флуоресценции клеток в составе органоида мозга, чтобы выявить, как меняется уровень исследуемого нами метаболита или параметра.
По последним данным наших экспериментов, мы не наблюдаем избыточной продукции пероксида водорода в процессе гипоксии/реоксигенации. Из этого следует, что указанный метаболит не является ключевым источником активных форм кислорода в острой фазе ишемии-реперфузии. Такие выводы сопоставимы с результатами, полученными нашими коллегами in vitro на первичных нейронах гиппокампа мыши и in vivo на мозге крысы. Это может говорить о работоспособности представленной модели и возможности ее использования для скрининга химических веществ в рамках изучения данной патологии.
Справка
Нейрокампус — консорциум научных и медицинских организаций, флагманами которого являются РНИМУ им. Н.И. Пирогова, Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России, Институт биоорганической химии РАН, а также Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.
В рамках стратегического проекта будут развиваться новые медицинские нейротехнологии, способные серьезно повлиять на качество медпомощи в области неврологии и нейрореабилитации. Исследовательские проекты под патронажем Нейрокампуса помогут совершенствовать область синтетической нейробиологии и нейроинтерфейсов, что позволит создавать уникальные фармацевтические препараты и медицинские устройства для терапии заболеваний нервной системы и повышения эффективности нейрореабилитации.
27.01.2023, 549 просмотров.
