NatComm: Нанобиосенсоры открывают широкие возможности в медицинской диагностике

Биосенсоры — это устройства, которые обнаруживают присутствие определённых веществ с помощью биологических молекул. Они могут выявлять биомаркеры заболеваний, молекулы, участвующие в различных процессах в организме, а также токсины и другие вредные вещества в окружающей среде.

Один из распространённых типов биосенсоров — флуоресцентные. В них есть биомолекула, которая связывается с мишенью, и молекула-зонд, излучающая флуоресцентный свет. Однако такие биосенсоры не всегда дают точный результат, потому что их зонды постоянно активны, а несвязанные молекулы нужно смывать.

Флуоресцентные биосенсоры с активацией связывания (наносенсоры) — большое достижение. Они загораются, только когда связываются с молекулой-мишенью. Но их сложно создать: нужно объединить эффективное связывание с мишенью и флуоресценцию в небольшом молекулярном пакете. При этом пакет должен быть пригоден для доставки в разные образцы, а производство — быть экономически эффективным.

Исследователи из Института Уисса при Гарвардском университете, Гарвардской медицинской школы, Массачусетского технологического института и Эдинбургского университета создали платформу синтетической биологии. Она упрощает открытие, молекулярную эволюцию и производство небольших наносенсоров. Эти сенсоры обнаруживают специфические белки, пептиды и малые молекулы, усиливая их флуоресценцию до 100 раз менее чем за секунду.

В платформе используются новые флуорогенные аминокислоты (FgAA). С помощью инновационной методики их можно закодировать в небольшие белковые последовательности, которые связываются с мишенью (биндеры).

Благодаря высокопроизводительному скринингу датчиков и направленной эволюции, платформа позволяет быстро и с минимальными затратами превращать связывающие белки в наносенсоры. Они могут применяться в фундаментальных исследованиях, экологическом мониторинге, медицинской диагностике и расширенной терапии.

Результаты исследования опубликованы в журнале Nature Communications.

Джордж Черч, руководитель исследования и профессор генетики в HMS, а также профессор наук о здоровье и технологий в Гарвардском университете и Массачусетском технологическом институте, рассказал, что учёные давно работают над расширением генетического кода клеток. Это нужно для исследований, биотехнологий и медицины.

Новое исследование является продолжением этой работы in vitro. С помощью новых химических технологий учёные модернизируют белки. Новая платформа синтетической биологии решает многие проблемы на этом пути. Она способна повлиять на многие области биомедицины.

Белок плюс каркас равно наносенсор

Команда под руководством Эркина Куру, доктора философии из группы Черча, основывалась на предыдущем открытии. Они выяснили, что FgAA могут превращать белковые связующие в оптические сенсоры. Флуоресценция этих сенсоров включается, когда FgAA оказывается между связующей последовательностью и целевой молекулой.

В исследовании также участвовал Марк Вендрел, доктор философии, профессор Эдинбургского университета. Он эксперт в области трансляционной химии и биомедицинской визуализации. Куру и Вендрел давно интересуются FgAAs.

Работая над проблемой пандемии, команда исследователей сосредоточилась на создании миниатюрного инженерного антитела (нанотела), которое связывается с белком Spike вируса SARS-CoV-2.

Они создали сотни вариантов связующего вещества. В них химически соединяли аминокислоты цистеина или лизина, введённые генетически в позиции, которые тесно контактируют с мишенью Spike, с одним из 20 различных химических флюорогенных каркасов. С помощью простого анализа связывания были отобраны те варианты, которые после соединения с мишенью давали наибольшее увеличение флуоресценции за миллисекунды.

Они создали наносенсоры из нанотел или мини-белков, которые связываются с различными мишенями, включая SARS-CoV-2 и EGFR (рецептор клеточного фактора роста, важный для рака), ALFA-tag (пептид, используемый для отслеживания белков внутри клеток) и кортизол (гормон стресса).

Наносенсоры эффективно сигнализировали о присутствии своих мишеней в клетках человека и живых бактериях под микроскопом.

Эволюция наносенсоров

Хотя первая версия платформы обладала потенциалом, она была ограничена. Процесс работы был долгим и трудоёмким и включал несколько этапов очистки полученных последовательностей.

Мы хотели расширить возможности молекулярного дизайна и повысить производительность платформы, — говорит Куру.

Для этого мы позволили рибосоме синтезировать большую часть белков вне клеток.

В версии 2.0 своей платформы команда изготовила синтетическую аминокислоту с флуорогенным каркасом. Синтетические аминокислоты уже используются в терапевтических средствах, таких как препарат для похудения Ozempic. Однако их нельзя легко включить в белковые последовательности, поскольку для них не существует естественного механизма работы с рибосомой.

Чтобы преодолеть это препятствие, мы использовали новую химию генетического расширения и изменили редко используемый кодон в универсальном генетическом коде так, чтобы он мог кодировать синтетические аминокислоты. По сути, мы модернизировали процесс синтеза белка для создания флуоресцентных наносенсоров, которые активируются связыванием, — рассказал соавтор работы Джонатан Риттичер, доктор философии, один из разработчиков метода.

Учёные усовершенствовали процесс производства наносенсоров. Теперь они могут синтезировать миллионы кандидатов одновременно и сразу соединять их с целевой молекулой или добавлять в живые клетки без дополнительной очистки. Это позволило увеличить производительность: за день можно исследовать сотни вариантов, а не несколько десятков в течение нескольких недель.

Учёные также обнаружили особое положение для кодирования FgAA в оригинальной связке SARS-CoV-2 nanobody. Благодаря этому улучшенный наносенсор стал более активно связываться с белком Spike по сравнению с оригинальным COVID-19 наносенсором.

Команда оптимизировала последовательность нанободи с помощью метода направленной эволюции. Этот метод заключается в итеративных циклах проектирования, строительства и испытания белков. В каждом цикле выбираются версии белка с максимальными возможностями, чтобы на их основе искать ещё более совершенные в следующем цикле.

Куру, Риттихье и команда создали обширные библиотеки нанободи на основе лучшего наносенсора, который они сконструировали для обнаружения белка Spike оригинального штамма SARS-CoV-2.

В этих библиотеках нестандартный FgAA остался на прежнем месте, но стандартные аминокислоты в других критических позициях были заменены на другие. Эволюция лучших из них привела к созданию новых наносенсоров с более высокой степенью сродства к белку Spike.

Используя подправленную версию этой системы направленной эволюции, они также обнаружили наносенсоры, которые могут избирательно обнаруживать различные новые варианты Omicron.

Вендрелл сказал: Это большой прогресс — теперь мы можем быстро создавать недорогие флуоресцентные биосенсоры для диагностики заболеваний.

Куру добавил, что с помощью этой технологии можно создавать новые терапевтические средства и исследовательские инструменты.

Хелена-де Пуиг, Элисон Флорес, Черч и Джеймс Коллинз также работают над проектом AminoX Института Wyss, который использует эту технологию для создания новых методов лечения.

Эта инновационная работа позволяет создать новое поколение биосенсоров. Они активируются связыванием и имеют большой потенциал для решения многих проблем в диагностике и терапии, — заключает Дональд Ингбер, основатель и директор Wyss.

05.09.2024