Virology: Ученые создали белок рецептора COVID в клетках мыши

Группа ученых из Брукхейвенской национальной лаборатории Министерства энергетики США и Колумбийского университета продемонстрировала способ получения большого количества рецептора, с которым связывается вирус SARS-CoV-2, вызывающий COVID-19, на поверхности человеческих клеток.

Это связывание знаменитого вирусного белка-шипа с человеческим рецептором ACE2 является первым этапом заражения вирусом. Создание функционального человеческого белка ACE2 в клетках мыши дает ученым новый способ изучить эти рецепторы и потенциально применить их на практике. Кроме того, как говорится в статье, опубликованной в журнале Virology, этот метод может облегчить изучение других сложных белков, которые оказалось трудно получить другими способами.

Первоначальной целью брукхейвенских ученых в начале пандемии было получение большого количества человеческого ACE2, а затем прикрепление этого белка к наночастицам. Затем наночастицы с покрытием ACE2 можно было бы испытать в качестве антивирусной терапии и/или сенсоров для обнаружения вирусных частиц.

Для любого из этих применений необходимо большое количество белка, причем белок должен быть полностью функциональным, — говорит вирусолог из Брукхейвенской лаборатории Пол Фреймут (Paul Freimuth), который руководил исследованием в сотрудничестве с учеными из Центра функциональных наноматериалов Брукхейвенской лаборатории (CFN).

Но создание функциональных мембранных белков, таких как ACE2, является особенно сложной задачей, поскольку процесс локализации белков в клеточной мембране является сложным.

Одна из причин заключается в том, что эти белки подвергаются различным модификациям после их синтеза и до того, как они встраиваются в клеточную мембрану. В частности, молекулы углеводов, добавляемые к белкам, играют ключевую роль в том, как длинная белковая цепь сворачивается в конечную 3D-структуру и как белок функционирует в мембране.

Углеводы составляют около трети массы белка ACE2, — говорит Фреймут.

Простейшие клетки, которые ученые используют для искусственного создания белков, а именно бактерии, не имеют ферментов для присоединения этих углеводных добавок. Поэтому брукхейвенская команда обратилась к клеткам мышей, которые, будучи млекопитающими, больше похожи на нас и, следовательно, способны выполнять ту же самую обработку углеводов. Мышиные клетки известны тем, что умеют подхватывать и экспрессировать «чужие» гены. И хотя мышиные клетки также производят рецептор ACE2, мышиная версия этого белка не связывается с шипом SARS-CoV-2. Это означает, что ученые могли бы легко проверить, производят ли мышиные клетки человеческий белок ACE2, посмотрев, связываются ли шипы с клетками.

Поиск и экспрессия гена ACE2

Чтобы увеличить шансы на то, что клетки мыши правильно встроят и прочитают человеческий ген ACE2, группа использовала неповрежденный ген. Гены человека и других «высших организмов» содержат много информации в дополнение к последовательности ДНК, которая кодирует строительные блоки аминокислот, составляющие белок. Эта дополнительная информация помогает регулировать структуру и функционирование генов в хромосомах клетки.

Ученые исследовали библиотеки клонированных фрагментов ДНК, созданных в рамках проекта «Геном человека» — финансируемого Министерством энергетики США проекта по определению местоположения всех генов, которые делают нас людьми, — и нашли фрагмент, содержащий неповрежденный ген ACE2 со встроенной в него регуляторной информацией. Затем они подвергли клетки мышей воздействию наночастиц, покрытых этим фрагментом ДНК, а также геном другого белка, который делает клетки устойчивыми к смертельному антибиотику.

В данном случае наночастицы служат агентом доставки ДНК, который захватывается клетками, чтобы ДНК могла интегрироваться в хромосомы мышиных клеток, — говорит Фреймут.

Чтобы найти клетки, которые приняли чужеродный ген (гены), мы добавляем антибиотик в клеточные культуры. Клетки, которые не смогли принять и экспрессировать ген устойчивости к антибиотику, погибли, в то время как те, которые приобрели устойчивость к антибиотику, выжили и выросли в колонии.

Ученые разделили около 50 таких колоний на отдельные культуры, а затем протестировали их, чтобы определить, сколько из них также восприняли человеческий ген ACE2 и произвели человеческий рецепторный белок.

Обнаружение производства белка

Около 70% устойчивых к антибиотикам колоний экспрессировали человеческий белок ACE2 на поверхности клеток, — сказал Фреймут.

Дальнейший анализ показал, что эти колонии содержали в среднем 28 копий человеческого гена ACE2.

Важно отметить, что мышиные клетки удерживали «чужие» копии гена ACE2 и продолжали производить человеческий белок ACE2, кодируемый этими генами, на протяжении как минимум 90 клеточных поколений.

Уровень продуцируемого клетками человеческого белка ACE2 в целом был пропорционален количеству копий гена ACE2, интегрированных в геном мыши. Некоторые клоны мышиных клеток вырабатывали в 50 раз больше ACE2, чем обычно присутствует в мышиных клетках.

Ученые использовали различные методы, чтобы проверить, насколько функциональны человеческие белки ACE2, созданные на основе мыши. В частности, они продемонстрировали, что «псевдовирус», содержащий белок COVID spike, то есть непатогенный аналог SARS-CoV-2, может связываться с рецепторами и заражать клетки.

Анализы инфекционности показали, что человеческий белок ACE2, экспрессированный на этих мышиных клетках, полностью функционален, — сказал Фреймут.

Применение и последствия

Тем временем Олег Ганг и Фейюэ Тенг, соавторы исследования из CFN, изучают различные способы создания внеклеточных нановезикул, обогащенных ложным человеческим ACE2, для потенциального лечения COVID-19. Они также изучают возможность размещения белков ACE2 на наночастицах для потенциального применения в лечении инфекций или быстрого обнаружения вирусов.

Задача нановезикул на основе ACE2 заключается в усилении их нейтрализующего действия против SARS-CoV-2. Мы также ищем способы повысить чувствительность и специфичность связывания наночастиц, связанных с ACE2, чтобы сделать их полезными для диагностики вирусов. Оба подхода потребуют дальнейшей оптимизации, — говорит Тенг, научный сотрудник CFN, который много работал как над биологическими аспектами этого исследования, так и над потенциальными приложениями на основе нанонауки.

«Мы рады объединить достижения в области изготовления наноматериалов с биомолекулярными подходами для разработки новых терапевтических и сенсорных стратегий», — говорит Ганг, работающий в Колумбийском университете. „Это исследование позволило нам преодолеть некоторые методологические проблемы, поскольку наноматериалы и биосистемы требуют совершенно разных подходов к определению характеристик. То, что мы здесь узнали, важно для наших следующих шагов по совершенствованию биосенсинга на основе наночастиц“.

Помимо возможности применения рекомбинантного белка ACE2, работа также демонстрирует новый подход к получению широкого спектра сложных белков. В качестве примера можно привести огромное количество рецепторов клеточной поверхности, которые опосредуют бесчисленные биологические и болезненные процессы, а также промышленно важные белки, такие как моноклональные антитела и ферменты.

Наш метод использования неповрежденных генов вместе с клетками мыши, которые могут быть адаптированы для выращивания в огромных суспензионных культурах, подобных жидким бульонным культурам, используемым для выращивания бактерий, может способствовать крупномасштабному производству этих и других важных белков, — заключает Фреймут.

22.01.2024